Influence of phenotypic diversification on the interactions between B. velezensis GA1 and P. fluorescens CMR12a in biofilm and correlation with the resulting secondary metabolites profile

Abstract

In nature, bacteria are commonly found to form multispecies biofilms whose structures and functions are shaped by interspecies interactions. They remarkably exploit genetic and phenotypic heterogeneity as adaptative strategies to coexist in different environments and survive under various environmental stresses. Furthermore, multispecies biofilms develop particular properties which have considerable positive and negative impacts on human activities and health. One of the most important fields where they are highly considered is agriculture. Indeed, certain beneficial bacteria colonise the root surface and thus contribute to plant growth and pathogen control. In this respect, the interest of using consortia of Plant Growth Promoting Bacteria (PGPR) to improve their positive effects on agricultural productivity is rising. However, the interactions between these bacteria are understudied, especially in biofilms. In this context, a top-down approach has been adopted to design a synthetic dual-species biofilm formed by Bacillus velezensis GA1 and Pseudomonas fluorescens CMR12a, two important PGPR strains. Furthermore, the aims of this work are not only to provide clues about how the phenotypic diversity intervenes in the assembly of mixed biofilms but also to better understand how these bacteria interact in this lifestyle. Consequently, this work could allow the identification of the potential modifications of the biocontrol efficacy via the biofilm formation capacities and bioactive secondary metabolites (BSMs) production by the two partners. In order to achieve these objectives, mono- and dual-species biofilms were grown in a drip flow biofilm reactor (DFR) followed by flow cytometry identification of the different phenotypes, whereas the main BSMs of both strains were analysed through LC-MS methods. In this work, we firstly demonstrate P. fluorescens CMR12a competitive traits for the early steps of biofilm development (i.e. fast growth and spread) under favourable conditions for biofilm formation. Moreover, it has been observed that in mixed culture, early sessilin production by P. fluorescens CMR12a was increased when sensing the presence of B. velezensis GA1. Interestingly, this latter increased the surfactin production as a defence mechanism in response to this aggression. Facing the competitiveness of P. fluorescens CMR12a, B. velezensis GA1 was almost cleared out of the mixed biofilm but remained as spores and/or isolated resistant biofilm. Differently, when B. velezensis GA1 was incubated 24 h prior to the inoculation of P. fluorescens CMR12a, the formed biofilm made P. fluorescens CMR12a unable to attach. In the culture medium mimicking the rhizosphere environment, B. velezensis GA1 showed better ability to form biofilm than P. fluorescens CMR12a and therefore dominated in the mix. Furthermore, the results suggest that the presence of P. fluorescens CMR12a led to an increase of the B. velezensis GA1 biofilm and spore formation. Under the conditions tested, the strains showed competitive interactions. However, the interesting increase of antimicrobial polyketides (PKs) production of B. velezensis GA1 previously observed in planktonic co-culture was not significative in mixed biofilms. Moreover, analysed BSMs were as much or less produced in mixed biofilms as in single species biofilms. This work contributes to a better understanding of multispecies biofilms of these PGPR and suggests experimental methods for further investigations.

Dans la nature, les bactéries se retrouvent généralement sous forme de biofilms multi-espèces dont les structures et les fonctions sont façonnées par les interactions interspécifiques. Elles exploitent remarquablement l'hétérogénéité génétique et phénotypique en tant que stratégies adaptatives afin de coexister dans différents environnements et de survivre à divers stress. De plus, les biofilms multi-espèces développent des propriétés particulières qui ont des impacts positifs ou négatifs considérables sur la santé et les activités humaines. L'agriculture est un domaine dans lequel ils sont hautement considérés. En effet, certaines bactéries bénéfiques colonisent la surface des racines et contribuent ainsi à la croissance des plantes et au contrôle des agents pathogènes. À cet égard, il y a un intérêt croissant à utiliser des consortiums de bactéries favorisant le développement des plantes, ceci afin d’augmenter les effets positifs qu’ont ces bactéries sur la productivité agricole. Cependant, les interactions entre ces micro-organismes sont peu étudiées, surtout en biofilms mixtes. Dans ce contexte, une approche “top-down” a été adoptée pour générer un biofilm mixte synthétique à deux espèces formé par Bacillus velezensis GA1 et Pseudomonas fluorescens CMR12a, deux souches importantes de bactéries favorisant la croissance des plantes. Les objectifs de ce travail sont de fournir des pistes quant à la manière dont la diversité phénotypique intervient dans l'assemblage des biofilms mixtes ainsi que d’améliorer la compréhension des interactions entre ces bactéries dans ce mode de vie. Par conséquent, ce travail a aussi pour but d’identifier les modifications potentielles de l'efficacité de biocontrôle (en termes de capacité de formation de biofilm et de production de métabolites secondaires bioactifs) des deux souches lorsqu’elles sont associées. Afin d'atteindre ces objectifs, des biofilms mono-espèces et mixtes ont été cultivés dans un réacteur “drip flow”, les différents phénotypes des cellules ont été identifiés par cytométrie de flux et les principaux métabolites secondaires bioactifs des deux souches ont été analysés par des méthodes LC-MS. Dans ce travail, nous démontrons tout d'abord que, dans des conditions favorables à la formation de biofilm, P. fluorescens CMR12a présente des caractéristiques qui le rendent compétitif dans les premières étapes du développement du biofilm (sa croissance et sa propagation rapides). De plus, il a été observé qu'en culture mixte, sa production précoce de sessiline était augmentée lorsqu'il détectait la présence de B. velezensis GA1. Il est intéressant de noter que B. velezensis GA1 augmentait la production de surfactine comme mécanisme de défense en réponse à cette agression. Face à la compétitivité de P. fluorescens CMR12a, B. velezensis GA1 a presque été éliminée du biofilm mixte, mais est restée sous forme de spores et/ou de biofilm résistant isolé. D’autre part, lorsque B. velezensis GA1 a été incubée 24 h avant l'inoculation de P. fluorescens CMR12a, le biofilm formé a rendu P. fluorescens CMR12a incapable de s'attacher. Dans un milieu de culture imitant l'environnement de la rhizosphère, B. velezensis GA1 a montré une meilleure capacité à former un biofilm que P. fluorescens CMR12a et a donc dominé dans le mixte. En outre, les résultats suggèrent que la présence de P. fluorescens CMR12a a conduit à une augmentation de la formation de biofilm de B. velezensis GA1 ainsi qu’une augmentation de sa sporulation. Globalement, dans les conditions testées, les souches ont montré des interactions compétitives. Lors de travaux précédents, une augmentation intéressante de la production de polycétides antimicrobiens par B. velezensis GA1 avait été observée lorsqu’elle était en coculture planctonique avec P. fluorescens CMR12a. Cependant, dans le cas des biofilms mixtes étudiés, cette augmentation n’était pas significative. De plus, les autres métabolites secondaires bioactifs étaient soit autant soit moins synthétisés que dans les biofilms mono-espèces correspondants. Ce travail contribue à l’amélioration de la compréhension du fonctionnement des biofilms mixtes de bactéries favorisant la croissance des plantes et propose des méthodes expérimentales pour des études complémentaires futures.