Inhibiteurs de séparation de phase liquide-liquide : impact sur la réplication de l'herpèsvirus Cyprin 3

Abstract

La séparation de phase liquide-liquide (LLPS) est un mécanisme majeur d’organisation cellulaire. Elle permet la formation d’organelles sans membrane telles que le nucléole, les corps de Cajal et les granules de stress. Les condensats liquides qui en résultent permettent d’optimiser la cinétique ou la spécificité d’une réaction, ou de l’inhiber en séquestrant les réactifs. De plus, la LLPS est impliquée dans la structuration cellulaire, c’est ainsi qu’elle intervient dans la formation de l’hétérochromatine. Néanmoins, une aberration de la LLPS peut aboutir au développement de maladies neurodégénératives et de processus cancéreux. Certains virus utilisent la LLPS au cours de leur cycle de réplication. C’est le cas de l’herpèsvirus Cyprin 3 (CyHV-3). En effet, le laboratoire hôte a récemment mis en évidence des condensats de la protéine ORF112 autour du noyau de cellules infectées. L’importance de ce mécanisme pour la réplication du CyHV-3 n’est pas encore connue. Ce travail a pour but d’approfondir cette question.

Pour atteindre cet objectif, une revue de littérature sur les inhibiteurs de la LLPS a été réalisée et a mené à la sélection du 1,6-hexanediol (1,6-HD) et du 1,2-propanediol (1,2-PD). Dans un premier temps, leur cytotoxicité a été évaluée à l’aide de l’Incucyte S3. Par la suite, leur capacité à dissoudre les condensats d’ORF112 a été évaluée par microscopie confocale. Enfin, l’impact du 1,6-HD et du 1,2-PD sur la courbe de croissance virale a été évalué à l’Incucyte S3, grâce à une souche recombinante de CyHV-3 exprimant la protéine fluorescente verte (EGFP).

Aux concentrations non cytotoxiques, le 1,6-HD et le 1,2-PD ont dissous les condensats d’ORF112 à 12h post-infection. Néanmoins, la dissolution n’a pas été observée à 24h post-infection. Enfin, le traitement des cellules a permis de réduire la propagation virale, comparativement aux témoins. Cependant, le 1,2-PD semble moins efficace que le 1,6-HD.

En conclusion, ces résultats démontrent que la LLPS est un mécanisme important dans le cycle de réplication virale du CyHV-3. Une perturbation de ce mécanisme provoque un ralentissement de la propagation virale en culture cellulaire.

Liquid-liquid phase separation (LLPS) is a major mechanism of cellular organization. It leads to the formation of membrane-less organelles such as the nucleolus, Cajal bodies and stress granules. The resulting liquid condensates can optimize the kinetics or specificity of a reaction, or inhibit it by sequestering the reagents. In addition, LLPS is involved in cell structuring and is implicated in the formation of heterochromatin. However, abnormal LLPS can lead to the development of neurodegenerative diseases and cancerous processes. Some viruses induce LLPS during their replication cycle. Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3) has been shown to use this mechanism. Indeed, the host laboratory has recently identified condensates of ORF112 proteins around the nucleus in infected cells. The role of this mechanism in CyHV-3 replication is not fully understood. The aim of this work is to investigate this question further.

To reach this goal, a literature review on LLPS inhibitors was performed and led to the selection of 1,6-hexanediol (1,6-HD) and 1,2-propanediol (1,2-PD). Firstly, their cytotoxicity has been evaluated using Incucyte S3. Their ability to dissolve ORF112 condensates was then assessed by confocal microscopy. Lastly, the impact of 1,6-HD and 1,2-PD on the viral growth was monitored in Incucyte S3 using a recombinant strain of CyHV-3 expressing green fluorescent protein (EGFP).

At non-cytotoxic concentrations, 1,6-HD and 1,2-PD dissolved ORF112 condensates at 12h post-infection. However, dissolution was not observed 24 hours post-infection. Finally, the viral growth was decreased in the treated cells compared to the controls. However, 1,2-PD seems to be less effective than 1,6-HD.

In conclusion, these results demonstrate that LLPS is a component of the CyHV-3 viral replication cycle. Perturbation of this mechanism restricts viral growth in cell culture.