In vitro evaluation of the toxicological properties of mineral oil hydrocarbons: focus on 1-2 ring and 3+ ring moah classes and correlation with the hydrocarbon composition of these mineral oils

Abstract

Les hydrocarbures saturés d’huiles minérales (MOSH) et les hydrocarbures aromatiques d’huiles minérales (MOAH) sont des contaminants alimentaires omniprésents d'origine pétrolière. Les MOAH sont considérés comme une préoccupation toxicologique par l'Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA), en particulier pour les composés contenant trois anneaux aromatiques ou plus. Cependant, les données toxicologiques de tels composés sont peu nombreuses en raison des défis liés à leur obtention. Ce projet vise à évaluer les propriétés toxicologiques (ex., mutagénicité, génotoxicité) des fractions MOSH et MOAH à l’aide de divers tests toxicologiques, comme le test d'Ames et celui des micronoyaux, tout en associant ces résultats à une caractérisation détaillée des substances étudiées. Les objectifs de ce travail de fin d’étude se sont concentrés sur l'optimisation des protocoles évaluant ces propriétés toxicologiques et le fractionnement d’huiles minérales en fraction MOSH, MOAH et les sous-fractions associées. Le travail à été divisé en trois parties : La première partie est consacrée à l’élaboration d’un protocole de purification optimisé pour obtenir des fractions de MOAH pures à partir d’échantillons d’huiles minérales et également à la mise au point d’un autre protocole, optimisé pour fractionner MOAH en sous fractions relatives à leur nombre de noyaux aromatiques. La seconde partie consiste à exposer ces fractions purifiées à des cellules procaryotes et eucaryotes afin d’évaluer leurs propriétés toxicologiques. La troisième partie a examiné les méthodes industrielles officielles utilisées pour évaluer la conformité des huiles minérales à leur commercialisation (en termes de sécurité toxicologique), en cherchant à comprendre quelles compositions de MOAH étaient positives au test (donc, considérées comme toxiques) et s’ils étaient pertinents sur le plan toxicologique. La purification des échantillons a produit une quantité importante de MOAH purifiés, mais a nécessité une optimisation des conditions d'élution selon la composition des échantillons. La solubilisation de ces fractions purifiées a été cruciale pour la réalisation des tests toxicologiques. La viabilité cellulaire a été évaluée, ainsi que la concentration maximale de MOAH ne compromettant pas cette viabilité. Le test d'Ames a évalué la mutagénicité des échantillons, le test étant positif pour l'échantillon Moltox (reference oil N°1). De plus, le test des micronoyaux sur des hépatocytes de la lignée cellulaire humaine HEPG2 a révélé un effet génotoxique de cet échantillon Moltox. Enfin, la méthode industrielle utilisée pour évaluer la conformité des huiles minérales aux normes de sécurité a montré des résultats intéressants. Basée sur la mesure spectrophotométrique de MOAH extrait par du DMSO, elle a révélé une extraction et une concentration des composés toxiques, ouvrant des perspectives intéressantes pour de futures méthodes de screening (par exemple, dans l'alimentation).

Mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) and mineral oil aromatic hydrocarbons (MOAH) are ubiquitous petroleum-derived products that contaminate food products. The MOAH fraction has been considered a toxicological concern by the European Food Safety Authority (EFSA), in particular regarding the compounds having three aromatic rings or more. However, toxicological data on these specific compounds are relatively scarce due to the many challenges in obtaining such information. The long-term goal of this project aims at evaluating the toxicological properties (e.g., mutagenicity, genotoxicity) of MOSH and MOAH fractions using various toxicological tests, such as the Ames test and the micronucleus test and associate them with a detailed characterization of the mixture tested. The objectives of this master thesis work were more focused on optimising the protocols necessary to assess these toxicological properties and to fractionate the minerals oils (MOs) to be evaluated into MOSH, MOAH and relative subfractions. The work was divided into three parts. The first part focuses on developing an optimised purification protocol to obtain pure MOAH fractions from mineral oil samples and a further optimised protocol for fractionating these fractions based on the number of aromatic rings. The second part involves exposing these purified fractions to prokaryotic and eukaryotic cells to evaluate their toxicological properties. A third part investigated the official industry methods used to evaluate the suitability of MOs for commercialization (in terms of toxicological safety), trying to understand which MOAH compositions gave positive responses (i.e., considered toxic), and whether these MOAH were toxicologically relevant. Sample purification produced a substantial amount of pure MOAH fractions but required optimization of the elution conditions based on the sample composition. Solubilization of these purified samples was crucial for toxicological testing. Cell viability was assessed and maximum MOAH concentration not compromising cell viability was determined. The Ames test evaluated the mutagenicity of the samples in both metabolized and unmetabolized forms, with Moltox reference oil No. 1 sample testing positive. Additionally, the mutagenicity assessment (micronucleus test) on human HEPG2 hepatocytes indicated that this same Moltox sample had a genotoxic effect on the cells. Finally, the method used by the industry to evaluate the compliance of a MO with safety standards showed interesting results. This method, based on the spectrophotometric measure of a DMSO extract of MOAH, showed to extract and concentrate the toxic compounds, opening interesting perspective in future direction for screening methods (for instance, in food).