Etude de la cinétique de pénétration d'huiles essentielles dans le mycélium de Phytophthora infestans en vue de développer un biofongicide

Abstract

La pomme de terre, Solanum tuberosum L., est appréciée par l’Homme puisqu’elle est facilement cultivable et génère de hauts rendements de biomasse comestible. Néanmoins, sa vulnérabilité face aux bioagresseurs et aux nombreuses maladies peut provoquer des pertes de rendements considérables. Le mildiou de la pomme de terre, causé par l’oomycète Phytophthora infestans (P. infestans), est la maladie la plus redoutée pour cette culture. Les huiles essentielles (HEs) sont des mélanges lipophiles complexes de molécules volatils issues du métabolisme secondaire de certaines plantes. Grâce à leurs propriétés antifongiques, les HEs seraient des candidates idéales pour lutter plus durablement contre P. infestans. Cependant, leurs modes d’actions sont encore peu connus. Ce travail a pour but de déterminer les sites cellulaires sur lesquels les HEs expriment leur potentiel fongicide afin d’évaluer leurs modes d’actions par la suite. Pour ce faire, une cinétique de pénétration a donc été effectuée dans le but de déterminer les sites d’actions des HEs et d’estimer leurs temps de pénétration au sein des différentes structures cellulaires du mycélium de P. infestans (paroi, membrane et cytoplasme).

Deux émulsions d’HEs, une d’origan (Origanum vulgare L.) et l’autre de cannelle (Cinnamomum zeylicanum), à une concentration de 1 µL/mL ont été préparées. Le mycélium de P. infestans a été immergé dans l’émulsion pendant une période de 15 minutes, 30 minutes, 2 heures et 6 heures. Il a ensuite été mis en contact avec différents solvants de polarité décroissante (eau, isopropanol et hexane) afin d’en extraire respectivement les composantes de la paroi (les β-glucanes et la cellulose) et de la membrane (les lipides) ainsi que les HEs adsorbées ou absorbées dans chacun de ces compartiments cellulaires. Ce protocole, initialement basé sur l’extraction de pesticides sur plantes, a donc été adapté et validé par des observations microscopiques. Le Rouge Congo et Rouge Soudan ont permis de colorer respectivement la cellulose de la paroi et les lipides de la membrane afin d’observer par microscopie les effets des solvants sur ces deux structures cellulaires. Les différentes extractions ont finalement été analysées en GC-MS afin d’identifier et quantifier le composé majoritaire de ces deux HEs : le carvacrol et le trans-cinnamaldéhyde. Les analyses statistiques (ANOVA et test de Tukey) ont été réalisées sur les concentrations de ces deux composés au sein des différents compartiments cellulaires et au cours du temps.

Les résultats de microscopie ont permis de valider que la méthode initialement utilisée sur plantes, a été correctement adaptée pour une utilisation appropriée sur du mycélium d’oomycète. En effet, l’isopropanol semble extraire une partie des glucanes tandis que l’hexane semble extraire une partie des lipides. Les résultats de pénétration ont, quant à eux, révélé que la paroi adsorbe très rapidement le carvacrol (dès 15 minutes) et en plus grande quantité que la membrane et le cytoplasme (après 6h : 0,25 µL/mL pour la paroi et 0,03 µL/mL pour la membrane et le cytoplasme). Bien que le cinnamaldéhyde présente une pénétration plus lente (2 heures) et des concentrations plus faibles, une tendance similaire au niveau de la paroi est observée (après 6h : 0,02 µL/mL pour la paroi). Au vu de ces résultats, l’HE d’origan serait donc prometteuse pour le développement d’un biofongicide.

Pour conclure, ce travail apporte de nouvelles connaissances sur la pénétration et les sites d’actions des HEs dans P. infestans, ouvrant ainsi la voie vers de nouvelles possibilités de recherches, notamment l’étude des modes d’actions de ces HEs sur la paroi cellulaire.

Potato, Solanum tuberosum L., is appreciated by Humans because it is easily cultivated and generates high yields of eatable biomass. However, its vulnerability to pests and many diseases can cause significant yield losses. Potato late blight, which is caused by the oomycete Phytophthora infestans (P. infestans), is the most feared disease for potato crop. Essential oils (EOs) are complex lipophilic mixtures of volatile molecules from the secondary metabolism of plants. Thanks to their antifungal properties, EOs would be ideal candidates for more sustainable control of P. infestans. However, their modes of action are not yet completely understood. This work aims to identify the cellular sites on which EOs express their fungicidal potential to evaluate their modes of action. A penetration kinetics was therefore performed to determine the sites of EOs actions and to estimate their penetration times within the different cellular structures of P. infestans mycelium (cell wall, membrane and cytoplasm).

Two EOs emulsions, one of oregano (Origanum vulgare L.) and the other of cinnamon (Cinnamomum zeylicanum), were prepared at a concentration of 1 μL/mL. This mycelium of P. infestans was immerged in this emulsion for 15 minutes, 30 minutes, 2 hours and 6 hours. The mycelium was then put into contact with different solvents of decreasing polarity (water, isopropanol and hexane) to extract respectively the components of the wall (β-glucans and cellulose) and membrane (lipids) and EOs absorbed or adsorbed in each of these cell compartments. This protocol, initially based on the extraction of pesticides from plants, was therefore adapted and validated by microscopic observations. To observe the effects of solvents on these two cell structures, Congo Red and Sudan Red colorants were used to colour respectively the cellulose in the cell wall and the lipids in the cytoplasmic membrane to ease microscopic observations. The different fractions were analyzed in GC-MS to identify and quantify their major compound of these two EOs: carvacrol and trans-cinnamaldehyde. Statistical analyses (ANOVA and Tukey’s test) were carried out for each concentration of these two compounds in different cell compartments over time.

The microscopy results confirmed that the method initially used on plants was correctly adapted for proper use on oomycete mycelium. Isopropanol seems to extract part of the glucans while hexane seems to extract part of the lipids. The penetration results have revealed that the cell wall adsorbs the carvacrol very rapidly (as early as 15 minutes) and in much greater quantities than what has been found in the membrane and cytoplasm (after 6 hours: 0.25 μL/mL for the wall and 0.03 μL/mL for the membrane and cytoplasm). Whereas cinnamaldehyde has a slower penetration (after 2 hours) and was found in lower concentrations, a similar tendency was observed in the cell wall (after 6 hours: 0.02 μL/mL for the wall). Given the results, the oregano EO seems promising for developing a biofungicide.

To conclude, this work brings new knowledge on the penetration and the sites of actions of EOs in P. infestans, opening the way to new research possibilities about the study of the modes of action of these EOs at the cellular level.