Wine Testing - From vineyard to wine: Detection and characterization of grapevine-infecting viruses, with a comparison of viral diversity in vineyards.

Abstract

Belgian viticulture, in strong expansion over the past decade, is exposed to a risk of viral diseases likely to reduce yield and impact the quality of grapes and wines. Among these pathogens, grapevine viruses and viroids attract particular attention due to their wide distribution, the absence of curative treatment, and their potential economic impact. The objective of this master’s thesis was to evaluate the feasibility of their detection in two matrices derived from grape processing: must and wine. The aim was to determine whether these matrices could serve as a support for molecular diagnosis and whether their use, in addition to leaves (a matrix commonly used for detection), could strengthen vineyard sanitary surveillance, particularly outside the growing season. The work was carried out in two complementary phases: the development and optimization of RNA concentration and extraction methods were conducted at the National Institute of Biology (NIB) in Ljubljana (Slovenia), while molecular detection was performed at the Laboratory of Integrated and Urban Phytopathology of Gembloux Agro-Bio Tech (University of Liège), in Belgium. Four concentration methods were compared: CP Select™ (InnovaPrep), Centricon® (Millipore Sigma), CIM monolithic chromatography (BIA Separations) and the Promega Maxwell® kit (Promega). Preliminary tests on artificially spiked commercial white wine made it possible to evaluate the recovery rate and concentration factor of each method by reverse transcription followed by a quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), targeting Tomato mosaic virus (Tobamovirus, Virgaviridae), Potato virus Y in double-stranded RNA form (Potyvirus, Potyviridae), and inactivated Avian influenza virus H5N1 (Alphainfluenzavirus, Orthomyxoviridae). The CP Select™ method stood out for its superior performance and was subsequently applied to musts and wines from vineyards participating in the VITIBEL project, a project that contributes to the development of viticulture in Belgium. RT-(q)PCR analyses targeted four viruses/viroids: Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (Foveavirus, Betaflexiviridae), Grapevine pinot gris virus (Trichovirus, Betaflexiviridae), Hop stunt viroid (Hostuviroid, Pospiviroidae) and Grapevine yellow speckle viroid-1 (Apscaviroid, Pospiviroidae). In wines, GRSPaV and GPGV were detected in two out of nine bottles analyzed. In contrast, in the two samples tested, GRSPaV, GPGV and HSVd were detected simultaneously, while GYSVd-1 was not identified in any case. The results showed that must, not subjected to fermentation and winemaking steps, constituted a more favorable matrix than wine for molecular detection, with fewer PCR inhibitors and better reproducibility of results. Wine, more complex in chemical composition (acidic pH of three to four) and rich in inhibitory compounds such as polyphenols, ethanol, or pigments, proved less suitable for reliable detection, although its technical feasibility was demonstrated in certain cases. This work represented the first in-depth evaluation of viral detection in these two matrices in Belgium and opened the way for their use alongside leaves in phytosanitary surveillance strategies.

La viticulture belge, en forte expansion au cours de la dernière décennie, est exposée à un risque de maladies virales susceptibles de réduire le rendement et d’impacter la qualité des raisins et des vins. Parmi ces pathogènes, les virus et viroïdes de la vigne suscitent une attention particulière en raison de leur large diffusion, de l’absence de traitement curatif et de leur impact économique potentiel. Ce travail de fin d’études avait pour objectif d’évaluer la faisabilité de leur détection dans deux matrices issues de la transformation du raisin : le moût et le vin. L’objectif était de déterminer si ces matrices pouvaient constituer un support de diagnostic moléculaire et si leur utilisation, en complément des feuilles (matrice couramment employée pour la détection), pouvait renforcer la surveillance sanitaire des vignobles, notamment en dehors des périodes de végétation. Les travaux ont été menés en deux phases complémentaires : le développement et l’optimisation des méthodes de concentration et d’extraction d’ARN ont été réalisés au National Institute of Biology (NIB) à Ljubljana (Slovénie), tandis que la détection moléculaire a été effectuée au Laboratoire de Phytopathologie Intégrée et Urbaine de Gembloux Agro-Bio Tech (Université de Liège), en Belgique. Quatre méthodes de concentration ont été comparées : CP Select™ (InnovaPrep), Centricon® (Millipore Sigma), chromatographie monolithique CIM (BIA Separations) et kit Promega Maxwell® (Promega). Des essais préliminaires sur vin blanc commercial artificiellement spiké ont permis d’évaluer le taux de récupération et le facteur de concentration de chaque méthode par transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaine quantitative (RT-qPCR), en ciblant le Tomato mosaic virus (Tobamovirus, Virgaviridae), le Potato virus Y sous forme d’ARN double brin (Potyvirus, Potyviridae), et le virus de la grippe aviaire H5N1 inactivé (Alphainfluenzavirus, Orthomyxoviridae). La méthode CP Select™ s’est distinguée par ses performances supérieures et a ensuite été appliquée à des moûts et à des vins provenant de vignobles participant au projet VITIBEL, projet qui contribue au développement de la viticulture en Belgique. Les analyses par RT-(q)PCR ont ciblé quatre virus/viroïdes : Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (Foveavirus, Betaflexiviridae), le Grapevine pinot gris virus (Trichovirus, Betaflexiviridae), le Hop stunt viroid (Hostuviroid, Pospiviroidae) et le Grapevine yellow speckle viroid-1 (Apscaviroid, Pospiviroidae). Dans les vins, le GRSPaV et le GPGV ont été détectés dans deux bouteilles sur neuf analysées. En revanche, dans les deux échantillons de moûts testés, le GRSPaV, le GPGV et le HSVd ont été détectés simultanément, tandis que le GYSVd-1 n’a été identifié dans aucun cas. Les résultats ont montré que le moût, non soumis aux étapes de fermentation et de vinification, constituait une matrice plus favorable que le vin pour la détection moléculaire, avec moins d’inhibiteurs de PCR et une meilleure reproductibilité des résultats. Le vin, plus complexe sur le plan chimique (pH acide de trois à quatre) et riche en composés inhibiteurs tels que les polyphénols, l’éthanol ou les pigments, s’est révélé moins adapté à une détection fiable, bien que sa faisabilité technique ait été démontrée dans certains cas. Ce travail a constitué la première évaluation approfondie de la détection virale dans ces deux matrices en Belgique et a ouvert la voie à leur utilisation en complément des feuilles dans les stratégies de surveillance phytosanitaire.