Development of generic and specific RT-PCR tests to study the diversity and ecology of yellow dwarf viruses in wild grasses

Abstract

Barley yellow dwarf viruses (BYDVs) and Cereal yellow dwarf viruses (CYDVs) represent one of the most damaging viral complexes affecting cereal crops worldwide. Among them, Barley yellow dwarf virus-BEL (BYDV-BEL) is a recently identified species in Belgium, for which very limited information is currently available. In the absence of specific detection methods, no reliable data existed on its true distribution or epidemiological role. The development of primers capable of specifically detecting BYDV-BEL therefore represents an essential step and constitutes a central contribution to this master’s thesis. Two total RNA extraction protocols were compared to obtain high-quality matrices for molecular detection: the method of Oñate-Sánchez & Vicente-Carbajosa (2008) and the commercial NucleoSpin® RNA Plant and Fungi kit (Macherey-Nagel). The kit yielded more reproducible and higher-quality RNA extracts and was therefore selected for all analyses carried out on fresh samples collected in 2025. Thirteen primer pairs, either generic or species-specific, were first evaluated in silico and subsequently tested in PCR. The analysis focused on inclusivity (detection of all target sequences) and exclusivity (absence of detection of non-targets). Several pairs were eliminated due to low inclusivity or insufficient specificity. Ultimately, three primer pairs were retained for further analyses: 1A (generic BYDV), 2A (generic CYDV), and 7A (BYDV-BEL specific). Pair 7A, designed and optimised by INRAE Bordeaux, represents the first primer set specifically dedicated to BYDV-BEL. Although it displayed satisfactory inclusivity, non specific amplifications were also observed, limiting its direct diagnostic application. In parallel, pair 7B, designed within this thesis, showed promising potential and deserves experimental validation to complement or eventually replace 7A. Two methodological optimisations were also explored. First, halving the RT-PCR reaction volume was tested as a cost-saving strategy. While technically feasible, this approach led to reduced sensitivity and false negatives, limiting its practical use. Secondly, multiplex RT-PCR assays were tested to combine several primer pairs in a single reaction. Although technical feasibility and a degree of internal reproducibility were confirmed, a loss of sensitivity was observed (particularly for BYDV) and the absence of independent validation means that this approach remains a perspective for future studies. Application of the selected primer pairs to Poa trivialis and Poa pratensis samples collected in 2025 confirmed the circulation of several BYDVs and CYDV-RPV, and most importantly, the re-detection of BYDV BEL in Belgium. This confirmation constitutes an important milestone, as it enables the integration of BYDV BEL into epidemiological surveillance programmes and consideration of its potential role as an emerging virus hosted by grassland species. In conclusion, this work established and evaluated the first molecular assays dedicated to the detection of BYDV-BEL, while comparing different extraction and amplification strategies. The results demonstrate the relevance of the commercial kit for RNA extraction, highlight both the potential and current limitations of primer pair 7A for BYDV-BEL, and confirm the importance of maintaining standardised RT-PCR conditions to ensure sensitivity. These findings provide a foundation for future studies on the distribution, impact, and epidemiological dynamics of BYDV-BEL in Belgium and potentially beyond.

Les virus responsables de la jaunisse nanisante (BYDVs et CYDVs) constituent l’un des complexes viraux les plus dommageables pour les céréales à l’échelle mondiale. Parmi eux, le Barley yellow dwarf virus-BEL (BYDV-BEL) est un virus récemment identifié en Belgique, pour laquelle très peu d’informations sont actuellement disponibles. En l’absence de méthodes de détection spécifiques, aucune donnée fiable n’existait sur sa distribution réelle ni sur son rôle épidémiologique. Le développement d’amorces capables de détecter spécifiquement BYDV-BEL représente donc une étape essentielle, et constitue un apport central de ce travail de fin d’études. Deux protocoles d’extraction d’ARN total ont été comparés afin d’obtenir des matrices de qualité adaptées à la détection moléculaire : le protocole de Oñate-Sánchez & Vicente-Carbajosa (2008) et le kit commercial NucleoSpin® RNA Plant and Fungi (Macherey-Nagel). Ce dernier a permis d’obtenir des extraits d’ARN plus reproductibles et de meilleure qualité, et a dès lors été retenu pour l’ensemble des analyses réalisées sur les échantillons frais collectés en 2025. Treize couples d’amorces, génériques ou spécifiques, ont été évalués in silico puis testés en PCR. L’analyse a porté sur l’inclusivité (détection de toutes les séquences cibles) et l’exclusivité (absence de détection des non-cibles). Plusieurs couples ont été éliminés en raison de leur faible inclusivité ou de leur manque de spécificité. Finalement, trois couples ont été retenus pour les analyses ultérieures : 1A (BYDV générique), 2A (CYDV générique) et 7A (BYDV-BEL spécifique). Le couple 7A, conçu et optimisé par l’INRAE de Bordeaux, constitue à ce jour le premier jeu d’amorces dédié à BYDV-BEL. Bien qu’il ait montré une inclusivité satisfaisante, des amplifications aspécifiques ont également été observées, ce qui limite son usage en diagnostic direct. En parallèle, le couple 7B, conçu dans le cadre de ce mémoire, présente un potentiel intéressant et mériterait d’être validé expérimentalement afin de compléter ou remplacer 7A. Deux pistes d’optimisation méthodologique ont également été explorées. D’une part, une réduction de moitié du volume réactionnel en RT-PCR a été testée pour évaluer son intérêt en termes d’économie de réactifs. Bien que techniquement réalisable, cette approche a entraîné une perte de sensibilité et l’apparition de faux négatifs, ce qui limite son usage pratique. D’autre part, des essais de multiplex RT-PCR ont permis de tester la combinaison de plusieurs couples d’amorces dans une seule réaction. Si la faisabilité technique et une certaine reproductibilité interne ont été confirmées, une perte de sensibilité a été constatée, en particulier pour BYDV, et l’absence de validation indépendante justifie de considérer cette approche uniquement comme une perspective de recherche. L’application des couples d’amorces sélectionnés à des échantillons de Poa trivialis et Poa pratensis collectés en 2025 a permis de confirmer la circulation de plusieurs BYDVs et du CYDV-RPV, et surtout de détecter à nouveau BYDV-BEL en Belgique. Cette confirmation constitue un jalon important, puisqu’elle permet désormais d’intégrer BYDV-BEL dans les programmes de surveillance épidémiologique et d’envisager son rôle potentiel comme virus émergent hébergé par des graminées prairiales. En conclusion, ce travail a permis de mettre en place et d’évaluer les premiers tests moléculaires dédiés à la détection de BYDV-BEL, tout en comparant différentes stratégies d’extraction et d’amplification. Les résultats démontrent la pertinence du kit commercial pour l’extraction, le potentiel mais aussi les limites actuelles du couple 7A pour BYDV-BEL, ainsi que l’importance de maintenir des conditions standardisées IV pour garantir la sensibilité des RT-PCR. Ces résultats ouvrent la voie à des études futures sur la distribution, l’impact et la dynamique épidémiologique du BYDV-BEL en Belgique et potentiellement au-delà.