Le gène ORF112 de l'herpèsvirus cyprin 3 est-il essentiel ou non ? Telle est la question

Abstract

L’herpèsvirus cyprin 3 (Cyprinid herpesvirus 3, Cyvirus cyprinidallo 3, CyHV-3) est l’un des cinq virus connus à ce jour pour exprimer une protéine contenant un domaine Zalpha (Zα). Il s’agit de la protéine ORF112. Les domaines Zα reconnaissent l’ADN et l’ARN double brin en conformation de pas gauche. Le laboratoire d’accueil a découvert antérieurement par mutagenèse du génome du CyHV-3 cloné sous la forme d’un chromosome artificiel bactérien (BAC) que le gène ORF112 est essentiel à la réplication du CyHV-3 en culture cellulaire. Cette conclusion reposant sur un système artificiel, le laboratoire d’accueil a tenu à confirmer la question de l’essentialité du gène ORF112 à l’aide d’autres approches. Par transfection du génome du CyHV-3 délété pour le gène ORF112 dans des cellules de carpe CCB génétiquement modifiées de manière à exprimer la protéine ORF112, il a été possible de multiplier le virus délété pour le gène ORF112 (ORF112 KO). De manière surprenante, le virus ORF112 KO a pu être par la suite multiplié sur des cellules CCB sauvages. Les objectifs de ce travail de fin d’étude ont été : (i) d’analyser le génome du virus ORF112 KO produit afin de déterminer si sa capacité à se multiplier malgré la délétion ne serait pas dépendante de modifications génétiques inattendues (récupération de la séquence de l’ORF112 à partir des cellules génétiquement modifiées ou mutations trans complémentantes) ; (ii) de comparer en culture cellulaire la multiplication du virus ORF112 KO et du virus sauvage. Les résultats obtenus démontrent que le virus ORF112 KO, capable de se multiplier en cellules CCB sauvages, ne possède pas de mutations inattendues qui pourraient trans complémenter la délétion. Ce résultat démontre donc que le gène ORF112 n’est pas essentiel. Néanmoins, les différentes approches mises en œuvre pour comparer la réplication du virus ORF112 KO et du virus sauvage ont toutes démontré que le virus délété présente une réplication fortement diminuée. Ce travail démontre que la caractérisation d’un gène viral comme essentiel sur base de la technologie BAC doit être traitée avec prudence. Ce travail procure de nouvelles pistes pour l’étude des fonctions de l’ORF112 du CyHV-3.

Cyprinid herpesvirus 3 (Cyvirus cyprinidallo 3, CyHV-3) is one of the five viruses currently known to encode a protein containing a Zalpha (Zα) domain, namely ORF112. Zα domains recognize left handed double stranded DNA and RNA. Using mutagenesis of the CyHV-3 genome cloned as a bacterial artificial chromosome (BAC), the host laboratory previously showed that the ORF112 gene is essential for CyHV-3 replication in cell culture. Because this conclusion relied on an artificial system, the laboratory sought to confirm the essentiality of ORF112 using alternative approaches. By transfecting a CyHV-3 genome deleted for ORF112 into genetically modified CCB carp cells engineered to express the ORF112 protein, it was possible to propagate the ORF112-deleted virus (ORF112 KO). Surprisingly, the ORF112 KO virus was subsequently able to replicate in wild-type CCB cells. The objectives of this work were: (i) to analyze the genome of the ORF112 KO virus produced, in order to determine whether its ability to replicate despite the deletion depended on unexpected genetic modifications (such as recovery of the ORF112 sequence from the genetically modified cells or trans complementing mutations); and (ii) to compare, in cell culture, the replication of the ORF112 KO virus and the wild-type virus. The results demonstrated that the ORF112 KO virus capable of replicating in wild-type CCB cells does not harbor unexpected mutations that could trans complement the deletion. This finding shows that the ORF112 gene is not essential. Nevertheless, all approaches used to compare the replication of the ORF112 KO virus and the wild-type virus showed that the deleted virus exhibits markedly reduced replication. This work highlights that the identification of a viral gene as essential using BAC cloning technology should be treated with caution. It opens new avenues for the study of ORF112 roles in the biological cycle of CyHV-3.