Production of a recombinant strain of Cyprinid herpesvirus 3 expressing ORF112 Zalpha domain as a photoconvertible fluorescent fusion protein - a major step for the study of ORF112 Zalpha intracellular trafficking

Abstract

Les domaines protéiques Zalpha ont une longueur de 66 acides aminés. Ils ont la propriété de se lier au dsADN (Z ADN) ou dsARN (Z-ARN) en pas gauche. A ce jour, les domaines Zalpha ont été décrits dans seulement trois protéines cellulaires et deux protéines virales. L’ORF112 du Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3) code pour une protéine contenant un domaine Zalpha. Récemment, le laboratoire hôte a démontré que le domaine Zalpha de l’ORF112 (partie C-terminale de l’ORF112) est essentiel et suffisant pour la réplication virale en culture cellulaire. Cette observation fait du CyHV-3 un modèle unique pour l’étude de la fonction biologique des domaines Zalpha. La localisation subcellulaire du Zalpha de l’ORF112 évolue au cours du cycle de réplication. Il apparait successivement dans le nucléole, dans les sites nucléoplasmiques de réplication de l’ADN viral et enfin dans des agrégats cytoplasmiques. Rien n’est connu de la mobilité de la protéine entre ces sites d’expression. Une approche élégante pour étudier la mobilité subcellulaire d’une protéine au sein de cellules vivantes repose sur l’expression de la protéine d’intérêt fusionnée à une protéine photoconvertible. La protéine mEOS dérivée du corail pierreux Lobophyllia hemprichii est une des protéines fluorescentes les plus utilisées à cette fin. L’expression de la protéine de fusion peut être initialement monitorée grâce à l’autofluorescence verte de mEOS. Une fois la protéine de fusion localisée dans une région d’intérêt de la cellule, d’où le traçage peut commencer, elle est irréversiblement convertie d’une fluorescence verte en rouge par excitation UV à l’aide du laser du microscope confocal. La redistribution du signal rouge en fonction du temps post-conversion peut être ensuite enregistrée pour étudier le transit subcellulaire de la protéine. Le but de ce travail de fin d’étude a été de produire une souche recombinante du CyHV-3 exprimant le Zalpha de l’ORF112 fusionné en son extrémité N-terminale à mEOS. Pour atteindre cet objectif, nous avons utilisé une approche combinant les technologies de recombinaison procaryotique et de recombinaison homologue en cellules eucaryotes. Tout d’abord, par recombinaison procaryotique, nous avons délété la cassette EGFP codée par le chromosome bactérien artificiel (BAC) d’un clone du CyHV-3 délété pour l’ORF112. Ensuite, le virus recombinant a été généré par co-transfection de cellule CCB à l’aide du BAC modifié et d’une cassette de recombinaison consistant en une séquence codante pour la protéine de fusion mEOS ORF112 Zalpha flanquée de régions de 500 paires de base en amont et en aval de l’ORF112 du CyHV-3. Cette approche a permis de produire avec succès un virus recombinant exprimant la protéine de fusion mEOS-ORF112 Zalpha et de réaliser les observations suivantes. La localisation subcellulaire de mEOS-ORF112 Zalpha au sein des cellules infectées est similaire à celle de la protéine ORF112 Zalpha sauvage, et tout comme cette dernière, elle co-localise principalement avec des accumulations de dsARN et non de dsADN. La photoconversion par traitement au UV de mEOS fusionné à ORF112 Zalpha a été démontrée au sein de cellules infectées vivantes. La conversion de mEOS-ORF112 Zalpha localisé au sein d’agrégats cytoplasmiques a révélé un transit intense de la protéine entre agrégats cytoplasmiques. Dans les cinq minutes suivant la photoconversion, il a été possible d'observer une re-localisation de mEOS-ORF112 Zalpha photoconverti (signal rouge) vers de nouveaux agrégats non-convertis (signal vert). Il a également été possible d'observer la migration au sein d'agrégats photoconvertis (signal rouge) de molécules mEOS ORF112 Zalpha non photoconverties (signal vert). Ces molécules non photoconverties pourraient avoir une origine cytoplasmique ou nucléaire. En conclusion, les résultats de ce travail de fin d’étude démontrent la faisabilité de l’utilisation de la photoconversion pour étudier le transit intracellulaire du Zalpha de l’ORF112 du CyHV 3. Le modèle développé permettra dans un avenir proche d’étudier le transit de la protéine entre ses différents sites de localisation intracellulaire. Les résultats préliminaires obtenus révèlent un transit intense du Zalpha de l’ORF112 entre agrégats cytoplasmiques contenant du dsARN.