Analyse du mode de biosynthèse de l'isopyoverdine, un sidérophore produit par Pseudomonas putida BTP1

Abstract

La pyoverdine est un sidérophore, molécule capable de chélater le fer, principalement produite par les bactéries appartenant au groupe des Pseudomonas fluorescents. Récemment, le mécanisme de biosynthèse de ce chromopeptide a été entièrement décodé. Ce travail est consacré à l’analyse du mécanisme de biosynthèse de l’isopyoverdine produite par la bactérie Pseudomonas putida BTP1. Cette molécule diffère de la pyoverdine par la liaison de la chaine peptidique au chromophore, celle-ci se trouve liée au carbone C3 du chromophore à la place du carbone C1 pour les pyoverdines. Une analyse bio-informatique a été réalisée pour déterminer les différences entre les gènes impliqués dans la formation de l’isopyoverdine de P. putida BTP1 et de la pyoverdine chez d’autres souches. Cette analyse a montré notamment que le gène pvdP de BTP1, impliqué dans la maturation et la cyclisation du chromophore, possède un pourcentage d’identité assez faible quand il est comparé au même gène provenant de souches produisant de la pyoverdine. De plus, en étudiant la structure primaire, secondaire et tertiaire de l’enzyme PvdP, des différences notables sont apparues principalement dans le domaine N-terminal de la protéine. Sur la base des résultats obtenus, un mutant de BTP1 délété du gène pvdP susceptible d’être responsable de la synthèse d’une isopyoverdine à la place d’une pyoverdine a donc été construit. Ce mutant a ensuite été complémenté avec le même gène d’intérêt provenant soit de P. putida BTP1, soit d’une souche produisant de la pyoverdine. Des cinétiques de croissance microbienne et de production du sidérophore de ces différents mutants ont été réalisées sur trois milieux de culture différents. Les surnageants de culture ont été analysés par LC-QTOF-MS. Le surnageant du mutant délété du gène pvdP ne fluoresce plus du fait qu’il produit le précurseur de l’isopyoverdine, la ferribactine, ne possédant pas un chromophore mature synonyme de fluorescence. Le mutant complémenté par le gène pvdP de la souche P. putida BTP1 et de la souche P. putida KT2440 permet de faire réapparaitre la fluorescence et de confirmer par analyse par LC-QTOF-MS la présence d’un pic correspondant au poids moléculaire de l’isopyoverdine produite par la souche sauvage de BTP1. En conclusion, l’enzyme PvdP pourrait être responsable de la formation de l’isopyoverdine de BTP1. Une confirmation de cette hypothèse pourrait être établie en purifiant les sidérophores produits par les différentes souches mutantes et en comparant leur structure par résonance magnétique nucléaire, seule technique permettant de faire la différence entre une pyoverdine et une isopyoverdine.

Pyoverdine is a siderophore, a molecule capable of chelating iron, mainly produced by bacteria belonging to the fluorescent Pseudomonas group. Recently, the biosynthetic mechanism of this chromopeptide has been fully decoded. This work is devoted to the analysis of the biosynthetic mechanism of isopyoverdine produced by the bacterium Pseudomonas putida BTP1. This molecule differs from pyoverdine by the binding of the peptide chain to the chromophore, which is linked to the C3 carbon of the chromophore instead of the C1 carbon for pyoverdines. A bioinformatics analysis was performed to determine the differences between the genes involved in the formation of isopyoverdine in P. putida BTP1 and pyoverdine in other strains. In particular, this analysis showed that the pvdP gene of BTP1, involved in the maturation and cyclisation of the chromophore, has a rather low percentage of identity when compared to the same gene from pyoverdine producing strains. Furthermore, when studying the primary, secondary and tertiary structure of the PvdP enzyme, notable differences appeared mainly in the N-terminal domain of the protein. Based on the results obtained, a BTP1 mutant deleted from the pvdP gene that could be responsible for the synthesis of an isopyoverdine instead of a pyoverdine was constructed. This mutant was then complemented with the same gene of interest from either P. putida BTP1 or a pyoverdine producing strain. Microbial growth and siderophore production kinetics of these different mutants were performed on three different culture media. The culture supernatants were analysed by LC-QTOF-MS. The supernatant of the pvdP gene-deleted mutant no longer fluoresces because it produces the isopyoverdine precursor, ferribactin, which does not possess a mature chromophore synonymous with fluorescence. The mutant complemented with the pvdP gene of P. putida BTP1 and P. putida KT2440 allows the fluorescence to reappear and to confirm by LC-QTOF-MS analysis the presence of a peak corresponding to the molecular weight of the isopyoverdine produced by the wild type BTP1 strain In conclusion, the PvdP enzyme could be responsible for the formation of isopyoverdine from BTP1. A confirmation of this hypothesis could be established by purifying the siderophores produced by the different mutant strains and by comparing their structure by nuclear magnetic resonance, the only technique that can distinguish between a pyoverdine and an isopyoverdine.