Étude fonctionnelle des séquences régulatrices activées par l'acide rétinoïque chez le poisson-zèbre

Abstract

L’acide rétinoïque est une molécule cruciale dans le développement de plusieurs organes chez les vertébrés, dont le pancréas. Ce morphogène agit en se liant aux protéines RAR qui sont des activateurs transcriptionnels, formant des hétérodimères avec les protéines RXR. Ces hétérodimères reconnaissent les séquences régulatrices « RARE » dans le génome permettant la modulation de l’expression de gènes cibles. De nouvelles séquences RARE ont été identifiées récemment chez le poisson-zèbre loin en aval du cluster des gènes hoxbb et en amont du gène gata6. Le but de ce mémoire était de déterminer l’activité de ces séquences RARE en aval du cluster hoxbb et de tester le rôle du gène gata6 dans la cascade de régulation induite par l’acide rétinoïque. Les sites RARE présents en aval du cluster hoxbb sont pour la plupart contenus dans le gène skap1 et montrent une conservation de leur position dans le génome de la souris et du poisson-zèbre. De plus, une de ces régions RARE (R2) témoigne d’une hyper-conservation chez les vertébrés. Pour investiguer l’activité régulatrice des quatre sites RARE (R1-R4), présents en aval du cluster hoxbb, nous les avons insérés dans des vecteurs rapporteurs en amont d’un promoteur minimal suivi du gène rapporteur codant pour la GFP. Nous avons ensuite généré des lignées transgéniques chez le poisson-zèbre avec ces vecteurs rapporteurs, permettant donc l’analyse du profil d’expression de ces éléments régulateurs. Nous avons observé que les profils d’activité des éléments R2 et R4 étaient fort similaires au profil d’expression du gène hoxb1b. Nous avons également confirmé l’activité RARE de ces deux sites régulateurs par des traitements à l’acide rétinoïque exogène et au DEAB, un inhibiteur de la synthèse de l’acide rétinoïque. Finalement, afin de vérifier le rôle des quatre sites régulateurs, nous les avons enlevés du génome du poisson-zèbre par la technique CRISPR-Cas9. Afin de vérifier le rôle du gène gata6 dans la cascade induite par l’acide rétinoïque, nous avons également inactivé ce gène à l’aide de la technique CRISPR-Cas9. L’analyse phénotypique de tous les mutants générés durant ce mémoire contribuera à une meilleure compréhension de la cascade régulatrice provoquée par l’acide rétinoïque et menant notamment à la formation des cellules pancréatiques. Ces résultats jettent de nouvelles perspectives quant à une meilleur compréhension de la cascade régulatrice provoquée par l’acide rétinoïque, menant notamment à la formation des cellules pancréatiques. En effet, une analyse phénotypique des mutants générés durant ce mémoire permettrait d’une part d’investiguer l’effet des délétions sur l’expression spatio-temporelle des gènes hoxbb et d’autre part, d’étudier le potentiel rôle médiateur de gata6 dans la cascade de régulation de l’acide rétinoïque.