Développement d'une méthode de suivi des réactions de cross-link des protéines par MALDI-MS

Abstract

Le pontage chimique (chemical crosslinking) est une technique visant à lier de façon covalente certains sites réactifs d’une protéine (ou d’un complexe protéique) spatialement proche. Après une réaction de pontage, l’échantillon est digéré puis est analysé par HPLC-MS/MS, mais à l’heure actuelle seul le résultat final est analysé. Il n’existe pas de méthode facile pour optimiser et suivre la réaction de la protéine avec l’agent de pontage. Durant ce mémoire, une méthode de suivis rapide et facile par MALDI-MS a été développée pour suivre les réactions de pontage au cours du temps sous différente condition expérimentale. Pour s’assurer de l’efficacité de la méthode, trois protéines modèles ont été sélectionnées pour couvrir une large gamme de masse : le cytochrome c (12 kDa) la BSA (66 kDa) et la phosphorylase b (97 kDa). Chacune de ces protéines a été pontée par deux réactifs de pontage : le BS3 et l’ADH couplé au DMTMM. Les résultats montrent que notre méthodologie MALDI-MS permet de suivre les réactions au cours du temps pour ces trois protéines. De plus, la plupart des résultats obtenus sont reproductibles et permettent de comprendre rapidement le comportement d’une protéine avec un agent de pontage. Par conséquent, il est aisé de sélectionner des conditions expérimentales et préparer une protéine avec un nombre de pontages désiré. Cette méthodologie est capable de jouer un rôle non négligeable dans l’étude de la réactivité des protéines avec les agents de pontage, mais aussi de créer le lien entre nombre de pontage par protéine et les informations structurales obtenues après HPLC-MS/MS.