Study of the effect of CATALASE 2 and its genetic interaction with TERMINAL FLOWER 1 on flowering in Arabidopsis thaliana

Abstract

Floral transition is a key step in the life cycle of angiosperms that needs to be tightly regulated. Several environmental conditions control it, such as photoperiod and winter cold. When these conditions are favourable, they activate downstream genes such as FLOWERING LOCUS T (FT), regarded as “the florigen”, which encodes a mobile protein acting as a systemic signal to trigger the switch of the Shoot Apical Meristem (SAM) from vegetative into floral fate. Another gene called TERMINAL FLOWER 1 (TFL1), represses this transformation of the SAM to keep it in an indeterminate state. Interestingly, the FT and TFL1 proteins are very similar but have completely opposite effects. Ongoing projects in the Laboratory of Plant Physiology in ULiège aim at understanding the antagonism between FT and TFL1 in the plant species Arabidopsis thaliana. Results obtained by co-purification (pull-down) experiments showed that the TFL1 protein interacts physically with CATALASE 2 (CAT2), a catalase that transforms H2O2 into H2O and O2. Moreover, recent studies showed that Reactive Oxygen Species (ROS), such as O2.- and H2O2, are involved in SAM functioning. This Master’s thesis aimed at investigating the link between ROS and flowering by two different approaches. First, we studied the genetic interaction between TFL1 and CAT2 by comparing 35S:TFL1 and cat2;35S:TFL1 plants. Second, the ROS landscape of the SAM was modified by expressing different ROS metabolism enzymes with the same spatio-temporal pattern (and cis-regulatory sequences) than genes that are activated in the SAM at the time of floral transition. The results showed that the cat2 mutation is able to suppress the 35S:TFL1 overexpression phenotype: the cat2;35S:TFL1 plants looked much like cat2 mutants, even at the vegetative state. In long days, the late flowering and abnormal inflorescence phenotypes of 35S:TFL1 plants were suppressed by the cat2 mutation since cat2;35S:TFL1 and cat2 plants flowered at the same time, only slightly later than WT, and formed normal inflorescences. By contrast, cat2;35S:TFL1 and cat2 plants flowered extremely late in short days, even later than 35S:TFL1 plants, indicating that they were strongly responsive to photoperiod. It was also observed that cat2 and cat2;35S:TFL1 plants had a longer juvenile phase, which could be correlated with a slower decrease of miR156 abundance compared to WT plants. For the second objective, transgenic plants expressing the RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) enzyme under the control of the promoter of different meristematic genes were created and several transformants were selected. Other transgenic T1 plants that expressed CAT2 under the promoter of TFL1 were also phenotyped. Overall, this Master’s thesis enabled us to better understand the genetic interaction between CAT2 and TFL1 and to create transgenic plants with an altered ROS landscape in the SAM, which will be valuable tools for further experiments.

La transition florale est une étape clé du cycle de vie des angiospermes, qui doit être très bien régulée pour ne s’enclencher qu’en conditions favorables. Différents facteurs environnementaux à variation saisonnière, comme la photopériode ou le froid prolongé, participent à cette régulation. Lorsque la photopériode est favorable (chez l’espèce étudiée Arabidopsis thaliana, il s’agit de jours longs), elle active des gènes comme FLOWERING LOCUS T (FT), qui code pour une protéine florigène mobile qui est synthétisée dans les feuilles, mais agit dans le méristème de tige (SAM, shoot apical meristem) pour stimuler sa transformation en méristème floral. Par contre, le gène TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) réprime cette transformation et maintient le SAM dans un état indifférencié. Les protéines codées par ces deux gènes sont très similaires au niveau de leur structure et appartiennent à une même famille, alors qu’elles ont des effets antagonistes. Des expériences antécédentes à ce mémoire ont montré que la protéine TFL1 interagit avec des protéines peroxysomales dont une catalase, CAT2, qui transforme H2O2 en H2O et O2. De plus, des études récentes ont montré que des espèces réactives de l’oxygène (Reactive Oxygen Species, ROS), comme l’H2O2 ou l’O2 .-, ont un rôle dans l’homéostasie du SAM. Ainsi, ce mémoire s’est intéressé au rôle de CAT2 et des ROS pendant la transition florale d’Arabidopsis thaliana. Nous nous sommes intéressés à l’interaction génétique entre CAT2 et TFL1 en analysant l’effet de la mutation cat2 sur le phénotype de plantes qui surexpriment TFL1 (35S:TFL1). Pour cela, nous avons réalisé des phénotypages de plantes cat2;35S:TFL1 en jours longs et jours courts. Nous avons observé que la mutation cat2 supprime le phénotype caractéristique d’une plante 35S:TFL1 en jours longs, ce qui confirme l’existence d’une interaction génétique entre CAT2 et TFL1. Les plantes cat2;35S:TFL1 ont en effet le phénotype des simples mutants cat2 : elles sont petites et ont des feuilles concaves, fleurissent avec un léger retard et ont des inflorescences normales, alors que les plantes 35S:TFL1 fleurissent beaucoup plus tardivement et ont des inflorescences portant de nombreux axes feuillus. Par contre en jours courts, les plantes cat2 et cat2;35S:TFL1 fleurissent extrêmement tard (>150 jours après le semis). Nous avons analysé si ce retard de floraison était corrélé à une prolongation de la phase juvénile, qui est en effet légèrement plus longue (quelques plastochrones), mais ne peut expliquer le retard observé en jours courts. Ces résultats suggèrent que la mutation cat2 impacte sévèrement les processus qui mènent à la floraison de manière autonome avec le vieillissement des plantes, mais pas la réponse à la photopériode. Une seconde approche entamée pendant le mémoire a été de perturber la distribution des ROS dans les SAM à la transition florale, en exprimant différentes enzymes du métabolisme des ROS sous le contrôle de promoteurs de différents gènes du méristème. Nous avons procédé au phénotypage de quelques individus T1 exprimant la construction pTFL1:CAT2, cultivés dans le but de produire la génération T2. Nous avons également réalisé les constructions génétiques (par « modular cloning ») et les transformations de plantes pour exprimer l’enzyme RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH), qui catalyse la production d’O2 .- à partir de l’O2 apoplastique, sous le contrôle du promoteur de différents gènes méristématiques. Nous avons obtenu des transformants utilisables pour la suite de ce travail. En conclusion, ce mémoire a permis de valider l’interaction génétique entre CAT2 et TFL1 et de construire des plantes transgéniques avec un paysage ROS altéré dans le SAM à la transition florale, qui seront analysées dans la génération suivante.