Expression d'une D-acide aminé oxydase de Rhodotorula gracilis chez la microalgue verte Chlamydomonas reinhardtii en vue d'établir un système inductible d'anoxie cellulaire

Abstract

Le dihydrogène (H₂) est un gaz aux multiples applications, notamment dans l'industrie, les transports et le stockage de l'énergie. Actuellement, sa production dépend principalement des combustibles fossiles, ce qui entraîne des émissions de gaz à effet de serre. Il est donc crucial de développer des méthodes pour optimiser la production d’H₂ tout en réduisant les émissions de CO₂. Une approche prometteuse consiste à utiliser la microalgue verte Chlamydomonas reinhardtii, organisme modèle en biologie végétale. L'algue possède deux hydrogénases capables de produire de l’H₂ dans des conditions physiologiques. Cependant, ces enzymes sont inhibées par le dioxygène (O₂). La réduction des niveaux intracellulaires d'O₂ pourrait donc augmenter la production d’H2. L'anoxie cellulaire pourrait être induite par l'expression d'une D-acide aminé oxydase (DAO) qui consomme de l'O2 pour oxyder les D-acides aminés. Les objectifs de ce mémoire sont (I) de construire un vecteur permettant l'expression de la DAO de Rhodotorula gracilis chez la microalgue, et (II) de mesurer l'activité de la DAO dans les transformants. Différents vecteurs ont été construits en utilisant la technologie de clonage modulaire (MoClo). Deux séries de transformants ont été analysées, la première exprimant la DAO en fusion avec la Nanoluciferase (NanoLuc), la seconde exprimant la DAO seule. Une comparaison de la consommation d'O2 dans des extraits protéiques des transformants issus des deux séries, il ressort que la fusion NanoLuc réduit l’activité de l’enzyme. Des tests supplémentaires sur des transformants exprimant la DAO seule ont montré que (I) la consommation d'O2 est plus efficace avec la D-alanine qu'avec la D-arginine, (II) elle est plus importante au pH optimal de l'enzyme (pH 8.0), (III) il n'y a pas de consommation induite par des L-acides aminés, (IV) la consommation d'O2 est stoppée par des inhibiteurs de la DAO. Toutes ces expériences prouvent que l'activité de la DAO est effectivement mesurée et que l’enzyme est exprimée dans les algues transgéniques. La prochaine étape de ce projet consiste à effectuer des tests sur des cellules entières et à mettre en place des systèmes dans lesquels l'anoxie est induite par l'ajout d'acides aminés D.