Analyse de deux facteurs de maturation de la machine SUF, HCF101 et NFU1, chez la microalgue Chlamydomonas

Abstract

Les centres fer-soufre (Fe-S) sont essentiels à l’activité de certaines protéines en raison de leur capacité à transférer des électrons. Cependant, les mécanismes de synthèse de ces centres Fe-S et leur transport vers les protéines cibles demeurent mal compris chez C. reinhardtii. Les connaissances actuelles sur ce sujet proviennent principalement de la plante Arabidopsis thaliana. Dans ce contexte, les protéines HCF101 et NFU1, impliquées dans le transfert des centres Fe-S aux protéines cibles du chloroplaste ont été caractérisées. Ce travail poursuit deux objectifs : examiner une éventuelle redondance fonctionnelle entre HCF101 et NFU1 et identifier les partenaires de HCF101. Pour réaliser le premier but, des doubles mutants hcf101 nfu1 ont été isolés par croisement entre les deux mutants simples et caractérisés. L'analyse de croissance a révélé une différence notable entre les doubles mutants et les mutants simples, que ce soit sous une intensité lumineuse moyenne ou élevée, ainsi qu'à l'obscurité. Les analyses des paramètres photosynthétiques indiquent également une différence significative entre les doubles mutants et les mutants simples. Le deuxième objectif est d’identifier les partenaires ou cibles de HCF101. Pour cela, le gène HCF101 fusionné à une séquence d’acides aminés correspondant à un peptide 3xFlag a été cloné par clonage modulaire (Moclo) et un transformant exprimant la construction a été isolé. Une expérience de coimmunoprécipitation (Co-IP) en utilisant un lysat chloroplastique réalisé à partir de la souche HCF101-3xFlag a été réalisée à l’aide d’anticorps anti-FLAG, en vue d’une identification des partenaires par spectrométrie de masse. Un WB a validé la présence de la protéine HCF101-3xFlag dans les éluats de la Co-IP. Les résultats de la Co-IP n’ont pas été obtenus avant la rédaction de mon mémoire.

Iron-sulfur (Fe-S) clusters are essential for the activity of certain proteins due to their ability to transfer electrons. However, the mechanisms of Fe-S cluster synthesis and their transport to target proteins remain poorly understood in Chlamydomonas reinhardtii. Current knowledge on this topic primarily comes from the plant Arabidopsis thaliana. In this context, the proteins HCF101 and NFU1, involved in the transfer of Fe-S clusters to target proteins in the chloroplast, have been characterized. This work has two objectives: to examine a possible functional redundancy between HCF101 and NFU1 and to identify the partners of HCF101. To achieve the first goal, double mutants hcf101 nfu1 were isolated by crossing the two single mutants and characterized. Growth analysis revealed a notable difference between the double mutants and single mutants, whether under medium or high light intensity or in darkness. Analyses of photosynthetic parameters also indicate a significant difference between the double mutants and single mutants. The second objective is to identify the partners or targets of HCF101. For this, the HCF101 gene fused with an amino acid sequence corresponding to a 3xFlag peptide was cloned using modular cloning (MoClo), and a transformant expressing the construct was isolated. A co-immunoprecipitation (Co-IP) experiment using a chloroplast lysate from the HCF101-3xFlag strain was performed with anti-FLAG antibodies to identify partners by mass spectrometry. A Western Blot (WB) confirmed the presence of the HCF101-3xFlag protein in the Co-IP eluates. The results of the Co-IP were not obtained before the writing of my thesis.