Caractérisation des mutants knock-out de la protéine CP29 du photosystème II et des enzymes DVR et CAO impliquées dans la voie de biosynthèse de la chlorophylle chez Euglena gracilis

Abstract

Ce mémoire a été réalisé sous la supervision de Pierre Cardol au Laboratoire de Génétique et Physiologie des Microalgues à l'Université de Liège. L'objectif principal de cette étude était d'élucider les rôles de la chlorophylle b et de la protéine CP29 dans l'organisation, la structure et la fonction de l'appareil photosynthétique de l'eucaryote photosynthétique Euglena gracilis. Nous avons caractérisé des souches mutantes knock-out (KO) générées par CRISPR-Cas9, déficientes pour la protéine d'antenne CP29 du photosystème II, ainsi que pour les enzymes chlorophyllide a oxygénase (CAO) et divinyl réductase (DVR), qui jouent un rôle clé dans la voie de biosynthèse de la chlorophylle. Pour ce faire, une série d'expériences a été réalisée, incluant des tests de croissance de mutants sous diverses conditions lumineuses, afin d'évaluer spécifiquement leur tolérance à ces variations. Les résultats ont révélé que les mutants CP29 KO n'ont montré aucun défaut de croissance significatif, tandis que les mutants CAO KO et DVR KO ont été sévèrement affectés sous des conditions de lumière intense (475 μmol Photon m-2·s-1). L'analyse de la composition des pigments par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) a confirmé l'inactivité des enzymes ciblées, entraînant une réduction marquée de la chlorophylle b et une diminution de la néoxanthine dans les souches CAO KO et DVR KO, ainsi que la présence exclusive de la divinyle chlorophylle a dans la souche DVR KO. De plus, l'analyse par spectrométrie de masse a confirmé l'absence de la protéine CP29 dans les mutants CP29 KO. Une analyse biochimique supplémentaire, utilisant l'électrophorèse sur gel natif à haute résolution (hrCN-PAGE), a révélé des différences structurelles substantielles dans les photosystèmes des mutants. Dans les trois types de mutants, les bandes correspondant aux supercomplexes du PSII (SC-PSII) étaient absentes, et dans les mutants CAO KO et DVR KO, une perte spécifique des trimères LHCII3 a été observée. Ces altérations structurelles ont été corroborées par des analyses spectroscopiques in vivo, incluant la fluorescence à température ambiante et à 77K. De plus, les mutants CAO KO et DVR KO ont montré une diminution de l'efficacité des mécanismes de photoprotection (qT), tandis qu'une réduction du taux de transport d'électrons relatif (rETR) a été observée exclusivement chez les mutants DVR KO. Dans l'ensemble, cette étude apporte des informations cruciales sur le rôle de la chlorophylle b et de la protéine CP29 dans l'intégrité structurelle et fonctionnelle de l'appareil photosynthétique d'Euglena gracilis, soulignant l'impact de ces composants sur l'efficacité de la collecte de lumière et la photoprotection.