Sélection et caractérisation de Nanobodies® dirigés contre TFIP11 et LasB

Abstract

Mon mémoire est scindé en deux projets distincts ayant pour point commun la sélection et la caractérisation de Nanobodies® (Nbs). Les Nbs sont des fragments d’anticorps dit à chaînes lourdes que l’on retrouve dans le sang des Camélidés. Découvert en 1989, les Nbs possèdent de nombreuses propriétés intéressantes qui ont conduit à leur utilisation accrue aussi bien pour la recherche fondamentale que pour des applications biotechnologiques ou encore médicales. Le premier projet concerne TFIP11. TFIP11 est une protéine impliquée dans de nombreuses interactions notamment, via son G-Patch, avec plusieurs composants importants du splicéosome. Les interactions avec ceux-ci ne sont pas toujours possibles dû à la présence ou à l’absence de modifications post-traductionnelles réversibles ce qui implique que l’épissage ne sera pas effectué. Actuellement, on ne connait pas les modifications post-traductionnelles nécessaires et suffisantes pour assurer la fonction de TFIP11 au sein du splicéosome. Ce premier projet vise à sélectionner des Nbs visant le G-Patch et plus particulièrement deux modifications post-traductionnelles de celui-ci. Ces Nbs permettront de réaliser des expériences telles que de la visualisation in vivo des modifications post-traductionnelles et ainsi mieux comprendre leur rôle pour la formation du splicéosome. Afin de réaliser la sélection des Nbs, un panning par phage display à partir d’une banque immune de gène de Nbs puis un screening par ELISA ont été réalisés. Les Nbs sélectionnés, ont été produits dans Escherichia coli et purifiés avant de caractériser leur capacité à se lier à TFIP11. Lors de ce projet, un seul Nb a été sélectionné, le Nb D108, mais après test de caractérisation par ELISA et interférométrie bio-couche (BLI), il ne se lie malheureusement pas au G-Patch de TFIP11. Le second projet concerne la métalloprotéase LasB de Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa est une bactérie, pathogène opportuniste, dans le top 3 des souches résistantes aux antibiotiques responsable de plus de 500 000 décès en 2019. La protéase LasB est une métalloprotéase à zinc et est l'un des principaux facteurs de virulence sécrété par P. aeruginosa causant des dommages aux tissus de l'hôte et diminuant la réponse immunitaire. Aucun inhibiteurs efficaces et sélectifs n’a pas été encore trouvé. Ce second projet vise à sélectionner des Nbs ciblant LasB et plus particulièrement inhibant spécifiquement et efficacement LasB selon la même stratégie que celle utilisé pour générer des Nbs contre TFIP11. Lors de ce projet, un seul Nb a été sélectionné, le Nb L276, mais après caractérisation par BLI, il ne se lie, malheureusement, pas à LasB.