Investigating the response to TH9619, a novel one-carbon metabolism inhibitor, in CLL/RS: Development and application of functional tools

Abstract

B-cell malignancies such as chronic lymphocytic leukemia (CLL) are frequently associated with resistance to conventional therapeutic agents, especially the highly aggressive form, Richter syndrome (RS), highlighting the need to identify new hallmarks, such as metabolic reprogramming, to develop new selective and targeted therapies. Malignant cells, including CLL/RS, rely on one-carbon (1C) metabolism, among others, to sustain nucleotide biosynthesis and epigenetic maintenance required for rapid cell proliferation. TH9619, a novel inhibitor of 1C enzymes MTHFDs, induces thymidylate depletion, DNA damage, and cell death of MTHFD2-expressing cells. Although TH9619 has demonstrated impressive cytotoxic activity against CLL/RS and various B-cell malignancies both in vitro and in vivo, some cells still exhibit limited or no response to this inhibitor. In this study, we investigated the mechanisms sustaining the response to TH9619. In particular, we focused on the role of serine hydroxymethyltransferase 1 (SHMT1), a cytosolic enzyme in the 1C pathway. Generated-resistant cells, derived from sensitive cells, exhibited high SHMT1 protein levels. Moreover, SHMT1 loss restored TH9619 sensitivity in resistant cells, indicating that SHMT1 is a key determinant of acquired resistance. To further explore SHMT1 regulation, we developed molecular tools by endogenously tagging SHMT1 with either NeonGreen or Flag-Tag. While the NeonGreen fusion impaired SHMT1 activity, the Flag-tagged clones retained functionality and proved suitable for further studies. Additionally, SHMT1 was successfully re-expressed in KO cells using a lentiviral overexpression system, restoring the resistance phenotype exclusively in generated-resistant cells. Collectively, these results identify SHMT1 as a critical element to regulate TH9619 response. These findings support SHMT1 as a potential predictive biomarker for therapeutic sensitivity to TH9619 in B cell malignancies. Furthermore, the genetic tools developed herein provide a reliable resource to further investigate SHMT regulation.

Les tumeurs malignes à cellules B, telles que la leucémie lymphoïde chronique (LLC), présentent fréquemment une résistance aux traitements conventionnels, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées. Des études récentes ont mis en évidence que la reprogrammation métabolique est une caractéristique des cellules cancéreuses et que celles-ci dépendent, entre autres, du métabolisme à un carbone (1C) pour maintenir la biosynthèse des nucléotides et la maintenance épigénétique nécessaires à une prolifération cellulaire rapide. Le TH9619, un nouvel inhibiteur des enzymes MTHFDs, cible sélectivement les cellules exprimant MTHFD2, provoquant une déplétion en thymidylate et un stress réplicatif. Bien que le TH9619 ait démontré une activité cytotoxique impressionnante contre diverses tumeurs malignes à cellules B, tant in vitro qu’in vivo, certaines cellules présentent encore une réponse limitée, voire inexistante, à cet inhibiteur. Dans cette étude, nous avons examiné les mécanismes soutenant la réponse au TH9619. Plus particulièrement, nous nous sommes intéressés au rôle de la sérine hydroxyméthyltransférase 1 (SHMT1), une enzyme cytosolique du métabolisme 1C, dans la résistance au TH9619. Des lignées cellulaires CLL sensibles et résistantes au TH9619 ont été modifiées par CRISPR-Cas9 afin de générer des clones SHMT1 knock-out (KO). Les tests de cytotoxicité ont révélé que l’inactivation de SHMT1 restaurait la sensibilité au TH9619 dans les cellules résistantes, sans affecter la prolifération cellulaire, ce qui indique que SHMT1 est un déterminant clé dans la résistance acquise. Afin d'explorer la régulation de SHMT1, nous avons développé des outils moléculaires permettant de marquer SHMT1 endogène avec NeonGreen ou Flag. Tandis que la fusion avec NeonGreen altère l’activité enzymatique de SHMT1, probablement en raison d’un encombrement stérique, la fusion avec le Flag conserve la fonctionnalité et se révèle appropriée pour des études ultérieures. Enfin, SHMT1 a été réexprimé avec succès dans les cellules KO à l'aide d'un système de surexpression lentiviral, ce qui a permis de restaurer le phénotype résistant. Ces résultats identifient SHMT1 comme un élément clé dans la régulation de la réponse au TH9619 et soutiennent son potentiel en tant que biomarqueur prédictif de la réponse au traitement par le TH9619. De plus, les outils génétiques développés offrent une ressource fiable pour la caractérisation fonctionnelle de SHMT1 dans le métabolisme du cancer.