Etude du développement des pièces osseuses chez le poisson zèbre en utilisant des poissons mutants et des transgéniques

Abstract

Le but de ce travail était d'étudier la fonction de certains gènes dans le développement osseux du poisson zèbre. Pour cela, nous avons utilisé l’outil d’édition de génome CRISPR-Cas9 afin d’introduire, par micro-injection dans des embryons de poissons zèbres à l’étape une cellule, des coupures d’ADNdb au niveau des gènes cibles pour y générer une mutation, mais aussi dans le but d’insérer un plasmide contenant la séquence codante pour une protéine fluorescente rapportrice (la Gfp). De cette manière, nous avons obtenu des poissons zèbres mutants pour les gènes bglap, col10a1a et spp1, mais aussi transgéniques pour le gène spp1 uniquement : la lignée Tg(spp1 :gfp). Le gène spp1 code pour l’ostéopontine, une protéine sécrétée dans la matrice extracellulaire osseuse et qui participe à la minéralisation du tissu osseux. Les lignées mutantes et transgéniques ont été séquencées par la méthode de Sanger, ce qui nous a permis, d’une part, d’identifier 6 lignées différentes mutées dans spp1, dont la lignée baptisée « 123del2 » qui comporte une délétion de 2 nucléotides au niveau du codon 123 au sein du gène spp1 et d’autre part, de vérifier la bonne insertion du plasmide contenant la séquence codante pour la Gfp chez les individus transgéniques. La lignée mutante 123del2 a été utilisée pour générer des larves mutantes homozygotes qui ont révélé un phénotype au niveau des éléments squelettiques constituants le crâne chez des larves âgées de 5dpf par coloration au rouge d’alizarine.

La lignée transgénique Tg(spp1:gfp) nous a permis, d’une part, d’établir un profil d’expression du gène spp1 au niveau des éléments squelettiques constituants le crâne et, d’autre part, d’observer l’effet de l’inhibition durant 24 heures de la voie BMP sur l’expression du gène spp1 en utilisant le K02288 comme inhibiteur. Le profil d’expression du transgène spp1:gfp a montré qu'il n’est pas exprimé chez les larves d’un âge inférieur à 3dpf et que son expression commence toujours par la partie dorsale du cleithrum (la première pièce osseuse crânienne à subir une minéralisation) et la partie haute de l’opercule, alors qu'à 5dpf, l’expression du transgène gagne progressivement la quasi-totalité des pièces osseuses crâniennes. L’effet de l’inhibition pendant 24 heures de la voie BMP avec l’inhibiteur K02288 diminue la longueur du cleithrum en diminuant l’expression du transgène spp1:gfp au niveau de cette pièce et cette diminution est d’autant plus importante si la concentration en inhibiteur est élevée. Ces résultats suggèrent que l’inhibition de la voie BMP affecte la minéralisation du tissu osseux. De plus, nous avons observé, en marquant la production du monoxyde d’azote « NO » des ostéoblastes par DAF-FM-DA, que l’inhibition de la voie BMP affecte l’activité des ostéoblastes, mais au niveau de certaines pièces osseuses uniquement.