Sondes structurales pour l'étude du mécanisme d'agrégation de l'alpha- synucléine en fibres amyloïdes

Abstract

L’alpha-synucléine (aSyn) est une protéine intrinsèquement désordonnée qui est synthétisée majoritairement dans le cerveau. Son agrégation en fibres amyloïdes qui s’accumulent dans la substantia nigra pars compacta sous forme d’inclusions intracellulaires appelées corps de Lewy, est associée à la maladie de Parkinson. Le processus d'agrégation est complexe et implique la formation d’espèces de tailles, structures et morphologies diverses. Par ailleurs, l’aSyn peut subir plusieurs modifications post-traductionnelles (MPT). Par exemple, 90% de l’aSyn retrouvée dans les corps de Lewy est phosphorylée au niveau de la sérine 129 (S129), alors que seulement 5% de l’aSyn l’est chez une personne saine. Le mécanisme moléculaire responsable de la neuro-dégénérescence, la nature exacte des formes toxiques et le rôle des MPT sont encore toutefois mal connus ; leur élucidation est toutefois cruciale afin d’identifier des cibles thérapeutiques. Etant donné que les protéines adoptent une conformation différente dans l’état monomérique, oligomérique et fibrillaire, l’utilisation de sondes structurales moléculaires, sensibles et spécifiques de chacune des espèces formées au cours du processus d’agrégation, est une approche de choix pour mieux comprendre au niveau moléculaire le processus d’agrégation. Dans ce contexte, la première partie de ce travail a consisté à générer des outils, i.e. des protéines chimères constituées de la protéine BlaP et de régions de l’aSyn, destinés à orienter la génération et/ou la sélection de sondes structurales (Nanobodies et Nanofitines) spécifiques de ces régions. Les régions de l’aSyn sélectionnées sont le domaine NAC qui compose le cœur des fibres amyloïdes et la S129 phosphorylée. Au total, cinq chimères ont été construites par recombinaison homologue : quatre d’entre elles (BlaP-aSyn1, 2, 3 et 4) contiennent des tailles différentes du domaine C-terminal (résidus 96-140 contenant la S129) afin d’estimer la taille minimale d’un insert permettant son accessibilité à la surface de BlaP ; la 5ième (BlaP-aSyn5) contient l’entièreté du domaine NAC. Les cinq chimères ont été produites de manière recombinante dans E.coli et purifiées par chromatographie d’affinité aux ions Ni2+ et échangeuse d’ions. Des mesures de dichroïsme circulaire et de fluorescence intrinsèque ont permis de montrer que les cinq protéines chimères ont des structures secondaires et tertiaires semblables à celle de la protéine BlaP. Des expériences de dot-blot, de BioLayer Interferometry BLI et/ou de phosphorylation de la sérine 129 par la kinase PKL3 ont permis d’établir que les régions d’intérêt des inserts des protéines BlaP-aSyn4 et BlaP-aSyn5 (i.e. la sérine129 et la région NAC, respectivement) étaient correctement exposées et accessibles à la surface de la protéine porteuse. En revanche, la sérine129 n’est que marginalement accessible à la kinase dans les chimères BlaP-aSyn1, BlaP-aSyn2 et BlaP-aSyn3. Afin de s’assurer du pouvoir immunogène des séquences d’aSyn insérées dans BlaP, des souris ont été immunisées avec BlaP-aSyn5. La présence d’IgG spécifiques du NAC dans les séra des souris, déterminée par Western-Blot, confirme l’immunogénicité de l’insert dans la protéine chimère BlaP-aSyn5. L’ensemble des résultats obtenus indiquent que les chimères BlaP-aSyn4 et BlaP-aSyn5 phosphorylées par PKL3 peuvent être utilisées pour générer/sélectionner des sondes structurales spécifiques de la S129 phosphorylée et du NAC de l’aSyn. La seconde partie de ce travail s’est centrée sur la génération d’un Diabody, résultant de la fusion de deux Nanobodies spécifiques de l’aSyn (i.e. Nb-Syn2 et de Nb-Syn87) via un peptide linker et sur l’étude de l’effet de sa liaison sur les cinétiques d’agrégation de l’aSyn. L’affinité du Diabody pour l’aSyn monomérique et fibrillaire n’est que marginalement augmentée par rapport à celle du Nanobody le plus affin, Nb-Syn87. Le peptide linker utilisé ne permet probablement pas aux deux Nanobodies de s’orienter correctement pour fixer simultanément leur épitope respectif. Des expériences préliminaires, visant à comparer les effets du Diabody et des Nanobodies Nb-Syn2 et NbSyn87 sur l’agrégation de l’aSyn en fibres amyloïdes, ont été réalisées via des mesures de la fluorescence de la ThT et de microscopie électronique à transmission. Dans les conditions utilisées, le Diabody et Nb-Syn87 inhibent complètement la formation de fibres amyloïdes par l’aSyn alors que Nb-Syn2 l’inhibe partiellement. L’inhibition de l’agrégation par Nb-Syn2 et Nb-Syn87 est en désaccord avec les résultats disponibles lorsque ce travail a été initié : les deux Nanobodies étant décrits comme n’affectant pas les cinétiques d’agrégation de l’aSyn. Toutefois, une publication très récente (août 2017) décrit des résultats similaires aux nôtres. Les disparités observées d’une étude à l’autre, pourraient s’expliquer par des faibles variations dans les conditions d’agrégation utilisées (avec ou sans seeds, avec ou sans agitation, ...) pour former les fibres et elles soulignent à nouveau la complexité du processus d’agrégation et l’intérêt d’utiliser des sondes structurales pour son étude.