Analyse de la fonction et de l'expression de l'inositide 5-phosphatase INPP5K dans des modèles cellulaires et murins

Abstract

INPP5K (Inositol Polyphosphate 5-phosphatase K) est une enzyme de la famille des phosphoinositides 5-phosphatases qui hydrolyse le groupement phosphate situé en position 5 du noyau myo- inositol des phosphoinositides. Les substrats d'INPP5K sont le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) et le phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3). La fonction d'INPP5K a surtout été étudiée in vitro avec des cultures cellulaires. Les résultats de ces expériences démontrent que l'enzyme possède un rôle important dans le contrôle de la signalisation cellulaire dans la réponse à l'insuline et dans la différenciation des myoblastes. Dans les études in vivo de la fonction de l'enzyme INPP5K, des souris INPP5K knock-out (KO) ont été produites par l'équipe de Takenawa en 2008. Ces souris mouraient prématurément durant la gestation au stade E10.5 pour des raisons inconnues. Les souris hétérozygotes présentent une sensibilité plus forte à l'insuline dans les muscles squelettique, en accord avec les résultats obtenus in vitro. Au laboratoire, des souris transgéniques surexprimant INPP5K ont été produites. Chez ces souris, la voie de signalisation AVPR2/AQP2 est amplifiée, avec pour conséquence une augmentation du nombre d'aquaporines dans le tube collecteur du rein amenant à une réabsorption d'eau plus grande de l'urine primaire. Les 2 objectifs de ce travail de fin d'étude proviennent des résultats obtenus par Bastien Moës l'année passée lors de son mémoire. Il avait constaté que l'expression protéique d'INPP5K était très importante dans l'intestin grêle, le colon et la peau. Le premier objectif était de développer des modèles cellulaires de ces organes permettant d'étudier INPP5K in vitro. Plusieurs modèles cellulaires furent investigués : HaCAt pour la peau, HCT116, HT29 différenciées et non différenciées pour l'intestin grêle et le colon. Les résultats obtenus par western blot et par qRT-PCR montrent une expression protéique et génétique de l'enzyme dans toutes ces cellules. Les résultats obtenus par immunofluorescence indirecte confirment sa présence, ainsi qu'une localisation préférentielle au niveau périnucléaire. Le deuxième objectif de ce travail était d'étudier in vivo chez la souris la fonction d’INPP5K dans l'épithélium intestinal et dans les kératinocytes de la peau. Nous avons utilisé des souris INPP5Kflox/flox Vil- Cre n'exprimant normalement plus INPP5K dans l'épithélium du tube digestif, et des souris INPP5Kflox/flox FoxN1-Cre n'exprimant normalement plus INPP5K dans les kératinocytes de la peau. Ces dernières souris n'exprimant plus INPP5K dans l'épithélium du thymus, le second site d‘expression de la recombinase Cre, nous avons ajouté le thymus et les lymphocytes T à notre étude. Les souris INPP5Kflox/flox Vil-Cre ne présentent pas de différence notable avec les souris contrôles. Les souris INPP5Kflox/flox FoxN1-Cre, quant à elles, possèdent un thymus de poids significativement plus faible, sans différence notable avec les souris contrôles dans les coupes d'organe colorées à l'hématoxyline-éosine. Chez ces souris, le nombre de thymocytes simples positifs est diminuée, ainsi que celui des lymphocytes T de la rate et des ganglions inguinaux. Ces résultats suggèrent que la perte d'INPP5K dans l'épithélium du thymus perturbe les propriétés des cellules de cet épithélium et entraine des anomalies de la maturation des thymocytes après que ceux-ci aient atteint le stade double positif.