Etude de l'interaction du domaine AMIN de l'amidase AmiC avec le peptidoglycane

Abstract

Ce mémoire de fin d’étude s’est intéressé à l’amidase AmiC qui est une hydrolase participant à la dégradation du peptidoglycane septal lors de la division d’E. coli. Plus précisément, ce mémoire s’interroge sur le domaine AMIN de cette amidase. Ce domaine a été identifié pour être indispensable à la localisation d’AmiC au site de division. De plus, in vitro, le domaine AMIN interagit avec le peptidoglycane. Cette observation permet d’envisager que, par l’interaction avec le peptidoglycane, le domaine AMIN permet la localisation d’AmiC au site de division. Cependant, les résidus responsables de l’interaction ne sont pas connus. Lors d’une première étude d’interaction du domaine AMIN avec le peptidoglycane, les résidus impliqués dans cette interaction ont été identifiés et vérifiés par modélisation. Ces derniers ainsi que les résidus conservés des deux feuillets beta ont été modifiés par mutagenèse dirigée. Dès lors, la première partie de ce mémoire était de finaliser une construction permettant la production de la protéine de fusion AMIN-sfGFP pour visualiser la localisation du domaine AMIN in vivo au microscope à fluorescence. Après l’obtention de la construction contenant le domaine AMIN sauvage et vérification de l’expression de celle-ci, les domaines AMIN mutés sont également introduits dans ce plasmide. En tout, 21 constructions sont obtenues. Elles doivent très prochainement permettre de déterminer la localisation, par microscopie à fluorescence, des mutants dans la bactérie en comparaison avec la protéine sauvage. La deuxième partie de ce mémoire a été de mettre au point les conditions de production de la protéine AmiC en milieu minimum, de la purifier et de cliver l’étiquette polyhistidine en vue de la préparation de la protéine marquée au 15N pour une étude par RMN de l’interaction d’AmiC avec le peptidoglycane. AmiC contient une étiquette polyhistidine qui ne doit plus être présente dans les échantillons. Dès lors, la protéase TEV, reconnaissant le site de clivage situé après la queue polyhistidine d’AmiC, est fraîchement produite et permet d’obtenir un meilleur rendement d’AmiC sans la queue polyhistidine. Le fait de produire AmiC en milieu minimum induit la surexpression de l’anhydrase carbonique qui se lie à la colonne de nickel et contamine les échantillons. L’utilisation d’une échangeuse de cation a permis d’éliminer l’anhydrase carbonique des échantillons. Lors du passage d’AmiC (dont l’étiquette polyhistidine a été clivée par la TEV) sur une colonne de nickel, une concentration de 25 mM en imidazole a été nécessaire pour récolter plus facilement AmiC. L’optimisation finale de la purification d’AmiC non marquée consistait à la produire dans 2 litres de milieu minimum et de purifier l’échantillon sur une colonne de nickel. Ensuite de passer les échantillons contenant His6-AmiC sur une colonne échangeuse de cation pour éliminer l’anhydrase carbonique et de terminer par un deuxième passage sur une colonne de nickel en présence de 25 mM d’imidazole après clivage avec de la TEV fraiche, afin de récolter AmiC pur et sans étiquette polyhistidine. Une production d’AmiC dans 2 litres de milieu minimum marqué au 15N a été également réalisée et est en attente de purification. Le peptidoglycane est, quant à lui, produit et purifié à une concentration de 500 mg/mL (2 ml au total) et doit être solubilisé pour l’étude en RMN.