Etude de la métallo -ß-lactamase de sous-classe B2 YEM-1, produite par Yersinia mollaretii Wauters

Abstract

Depuis plusieurs décennies, l’utilisation intensive et parfois abusive des antibiotiques est l’une des causes majeures de l’émergence de souches bactériennes résistantes. Parmi un ensemble de mécanismes développés par celles-ci pour contrer l’effet létal des antibiotiques, la production de β-lactamases est le moyen le plus répandu. Ces enzymes rendent les antibiotiques à noyau β-lactame inactifs par hydrolyse de leur noyau β-lactame. Les β-lactamases se divisent en deux familles, les β-lactamases à sérine active (classe A, C et D de la classification d'Ambler) et les métallo-β-lactamases (MBLs) (classe B), qui se répartissent à leur tour en trois sous-classes : B1, B2, B3. Les métallo-β-lactamases de sous-classe B2 sont des carbapénèmases strictes. Parmi les enzymes de cette sous-classe, CphA est une métallo-β-lactamase bien connue. Une analyse bioinformatique des banques de données, en utilisant la séquence de l'enzyme CphA comme référence, a permis d’identifier quatre nouvelles MBLs potentielles qui appartiendraient à la sous-classe B2. L’une d’entre elles, YEM-1, est produite par Yersinia mollaretii. Notre travail se porte sur la caractérisation de YEM-1. La protéine YEM-1 a été produite, purifiée et caractérisée. Etant donné qu’elle est supposée appartenir à la sous-classe B2, son profil d’activité est comparé à celui de CphA. L’étude cinétique de cette protéine montre une efficacité catalytique réduite pour l’ensemble des carbapénèmes testés (à l’exception de l’imipénème) par rapport à CphA. L'effet des ions métalliques (Zn2+, Co2+ et Cd2+) et d'agents chélatants (EDTA, phénantroline, acide dipicolinique) sur l'activité de YEM-1 montre qu'elle a une affinité réduite par rapport à CphA pour la fixation d'un second ion zinc et qu'elle est plus résistante à l'effet des chélatants. La comparaison de la structure tridimensionnelle de CphA et du modèle de la structure de YEM-1 met en évidence trois résidus (Y63, T158, S236) proches du site actif qui pourrait influencer l'activité enzymatique de YEM-1. Les résidus Y63 et S236 ont été modifiés par mutagenèse dirigée afin de restaurer les acides aminés présents chez CphA. Parmi ceux-ci le mutant Y63V de YEM-1 a été produit et purifié. Sa caractérisation cinétique démontre une augmentation de l’efficacité catalytique du mutant par rapport à l’enzyme sauvage.